Главная

Многообразие тяжелых цепей: соматические мутации

В дополнение к описанным выше опытам по анализу вклада гаметных генов в разнообразие VH с использованием методов клонирования был изучен и вклад соматических мутаций. Лучше других в этом отношении исследованы системы NPb и антифосфорилхолиновая.

Система NPb ответственна за необычный ответ мышей C57BL/6 на иммунизацию белками, несущими в качестве гаптена NP (4- гидрокси-З-нитрофени-лацетил): основная масса вырабатываемых антител укладывается в ограниченное число изоэлектрических форм и реагирует с полиспецифической антиидио-типической антисывороткой, которая определяет перекрестно-реагирующий идиотип, называемый NPb и специфический для гаплотипа IgHb. Для изучения генов VH, ответственных за этот идиотип, Ботуэлл и др. проклонировали кДНК генов Н-цепей из двух гибридом, продуцирующих антитела NPb. Клон IgM- кДНК был получен из гибридомы, сконструированной после первичного ответа, а клон IgG2a — из гибридомы, полученной после гипериммунного ответа. Последовательность нуклеотидов этих двух кДНК различалась по 10 положениям. Для поиска гаметного прототипа этих генов Ботуэлл и др. обследовали библиотеку ДНК C57BL/6 при помощи зонда, полученного из клона IgG2а-кДНК. Были выделены бактериофаги, содержавшие по крайней мере 14 гомологичных V-областей. В их состав входили все (кроме трех) фрагменты EcoRI, гибридизующиеся с этим зондом при блоттинге по Саузерну геномной ДНК C57BL/6. Исключение слабогибридизующихся клонов позволило уменьшить число «кандидатов» в возможные предшественники до пяти. В независимых опытах для уменьшения числа «кандидатов» клоны расщепляли рестриктазами и скринировали для отбора характерных фрагментов ДНК, предсказанных из последовательностей двух кДНК. Семь клонов (в это число вошли все интенсивно гибридизующиеся) дали картину, предсказанную для IgM-кДНК, но ни в одном случае распределение не совпадало с тем, которое ожидалось для IgG2а- кДНК. После определения последовательности семи предполагаемых предшественников оказалось, что один из них V186-2 точно соответствует клону IgМ-кДНК. Он и был принят в качестве гаметного предшественника этого клона. Ни одна из определенных последовательностей не совпала с областью VHIgG2a-клона и не содержала ни одной из 10 нуклеотидных замен, отличающих последовательность VH IgG2a-клона от последовательности IgM-клона. Авторы заключили, что V-область IgG2a-клона произошла также из V186-2, но подверглась соматическим мутациям. Возможность того, что последовательность VHIgG2a происходит от одного из немногих не попавших в клоны гомологичных гаметных генов VH, не была исключена полностью, но была признана невероятной, так как семь гаметных генов VH обладали одним общим свойством — большинство точек, в которых их последовательность отличалась одним нуклеотидом от V186-2, совпадало по последовательности по крайней мере еще с одним из других генов этого семейства. Все же 10 отличий, обнаруженных в IgG2а-кДНК, напротив, оказались уникальными, что предполагает их негаметное происхождение. Тот факт, что одни и те же отличия последовательности от V186-2 встречаются у нескольких гаметных генов, интересен и сам по себе, так как позволяет сделать важные заключения о генерации разнообразия гаметных генов. Эти общие отличия связывают каждый из гаметных генов со всеми остальными таким образом, который противоречит модели их образования по пути «дупликация — точковая мутация — дупликация и т. д.». Хотя до сих пор не вполне ясно, каков альтернативный механизм образования этих генов, рассматривались варианты с участием гомологичной рекомбинации между генами Vx и конверсии генов. Этот вопрос нуждается в дальнейшем изучении.

Иммунный ответ мышей на фосфорилхолин (ФХ) представляет собой удобную модель для изучения иммунной системы. В сочетании с гибридомной техникой и использованием рекомбинантных ДНК эта модель помогла получить интересные результаты о природе соматических мутаций. Гирхарт и др. исследовали аминокислотные последовательности ФХ-связывающих антител из 20 гибридом и 9 миелом. Для всех этих белков была определена последовательность 36 N-концевых остатков V-области Н-цепи, а последовательность 18 VH-областей была определена полностью. Обобщение полученных данных показало, что, за исключением J-областей (оказавшихся идентичными для всех изученных последовательностей) и D-областей (которые различались у всех изученных изотипов), все VH области ФХ-связывающих белков класса IgM обладали одной и той же аминокислотной последовательностью. В отличие от этого VH-области IgA включали в себя VH-районы, идентичные прототипической последовательности, а в некоторых случаях содержали до семи рассеянных аминокислотных замен. Большая часть VH-областей IgG содержала по сравнению с прототипом замены. При сравнении 30 L-цепей этих антител (в области остатков 1—36) были выявлены три прототипические последовательности. Все L-цепи IgM были идентичны одному из этих прототипов; отличия были найдены только в L-цепях IgG и IgA. Все варианты последовательностей как VH, так и VL оказались уникальными и, за одним исключением, каждая аминокислотная замена была уникальной и свойственной только данному варианту. По аналогии с описанными выше примерами эти сравнения позволяют предположить, что прототипические последовательности соответствуют гаметным генам, а их варианты—это продукты соматических мутаций.

В случае последовательностей генов VH этот вывод был подтвержден. Для определения числа генов, которые могли бы кодировать наблюдаемые последовательности VH-цепей, зонд, соответствующий последовательности-прототипу (полученный из S107) гибридизовали с перенесенной на фильтры гаметной ДНК; были обнаружены только четыре интенсивно гибридизующиеся полосы. Крюз и др. выделили из библиотеки геномной ДНК клоны, соответствующие каждой из этих четырех полос. Один из четырех генов — V1 — содержал нуклеотидную последовательность, точно кодирующую обнаруженный в описанных выше опытах прототип vH- Был сделан вывод, что этот ген представляет собой гаметный предшественник VH-области прототипа. В последовательности второго родственного гена произошел сдвиг рамки, превративший его в псевдоген. Два оставшихся гена кодировали, по всей видимости, вполне «жизнеспособные» области VH, однако их последовательности содержали так много аминокислотных замен, не наблюдавшихся ни в прототипе, ни в одной из вериантных последовательностей, что эти гены не могли быть кандидатами в гаметные пведшественники вариантных последовательностей. Считая, что эти четыре гена предстбвляют собой полный репертуар гаметных генов, кодирующих ФХ-связывающие VH-области, Крюз и др. сделали вывод, что первый из них, V1, должен быть предшественником как вариантных последовательностей, так n прототипа и что замены аминокислот должны быть вызваны соматическими мутациями. Тот факт, что вариантные последовательности обнаружены только в IgA и IgG, но не в IgM, привел к предположению, что соматические мутации не вносят вклада в разнообразие антител класса IgM, а способствуют лишь разнообразию «переключенных» изотипов. Это> положение представляет значительный интерес. Для того чтобы точнее оценить взаимосвязь между переключением изотипа и соматическими мутациями, необходимы дальнейшие эксперименты.

Для изучения природы соматических мутаций Ким и др. определили последовательности экспрессирующихся генов VH и фланкирующих (примыкающих) участков ДНК, которые были клонированы из двух миелом, продуцирующих ФХ-связывающие антитела с вариантными последовательностями VH: М167 (с восемью аминокислотными заменами по сравнению с прототипической последовательностью) и М603 (с тремя заменами). Ряд особенностей 5'-фланкирующей ДНК оказались идентичными у этих перестроенных генов и гаметного гена V1. Этот факт подтвердил, что ген V1 служит предшественником VH-областей как М167, так и М603. При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей предшественника и двух миеломных генов была обнаружена весьма примечательная локализация мутаций.

Распределение соматических мутаций в двух миеломных генах Vн

Гены VH двух ФХ-связывающих антител из миелом M167 (на рисунке обозначено как M1) и М603 были
клонированы, и соответствующие области их последовательностей сравнивались с гаметными предшественниками — геном
VH, последовательностью μ и областью Сна, клонированными из ДНК сперматозоида. Нуклеотидные замены
в каждом экспрессирующемся миеломном гене VH обозначены вертикальными
черточками. Шкала внизу указывает расстояние сравниваемых участков от D-области. Из сравнения последовательностей следует,
что соматические мутации наблюдаются только в ограниченном районе, окружающем рекомбинировавший блок VDJ; за пределами
расстояния в 4,6 тпн с 5'-стороны и 3,8 тпн с 3'-стороны от VD активные гены идентичны гаметному предшественнику. Такое
распо-ложение свидетельствует в пользу специфического «гипермутационного» механизма.

В гене М603 мутации были локализованы в кодирующей последовательности гена VH и в интроне между JH1 и JH2. В гене М167, расшифровка структуры которого продвинулась дальше, мутации наблюдались, начиная от области, расположенной с 5'-конца последовательности, кодирующей сигнальный пептид, в обоих кодирующих участках и во всех интронах исследуемой ДНК, захватывая участок, расположенный на расстоянии 2,3 тпн с З'-стороны от комплекса VDJ. Однако последовательности, располагающиеся в обоих направлениях еще дальше от VH-области (около 5 тпн в 5'-сторону VDJ и внутрь находящейся с 3'- стороны S-области и Cна-последовательности), оказались незатронутыми мутациями. «Сфокусированное» расположение мутаций позволяет предположить наличие специфического Ig-"гипермутационного" механизма, способного распознавать какие-то свойства ДНК, соседствующей с VDJ-последовательностью.

Эти исследования ФХ-системы неопровержимо доказали наличие соматических мутаций в генах L- и Н-цепей и тем самым подтвердили правильность выводов, сделанных в результате других исследований, в которых не было однозначно показано, что гаметные гены, идентичные наблюдающимся «вариантам», не утеряны в ходе клонирования. Кроме того, полученные данные позволили избавиться от беспокойства по поводу того, что мутации, наблюдающиеся в миеломных последовательностях,— результат искусственной индукции или культивирования миеломы в лабораторных условиях. Это следует из того, что мутации наблюдавшиеся в только что полученных гибридомах, были ограничены IgA и IgG (хотя IgM-миеломы, экспрессировавшие немутирующие последовательности, подверглись такой же обработке) и располагались в очень специфическом участке, окружающем ген V-области. Трудно себе представить, чтобы какой-нибудь артефактный механизм обладал такими свойствами.

Выявление мутаций не дало значительной информации о механизме их образования. Как мишенями, так и продуктами мутаций могут быть все четыре нуклеотида. Наблюдались как транзиции (замены пурин—пурин и пиримидин-пиримидин), так и трансверсии (замены пурин — пиримидин и наоборот), а также небольшие вставки и делеции. Поскольку мутации наблюдаются не только в гипервариабельных или определяющих комплементарность (CDR, complementarity determining regions) областях, обнаруживаясь иногда даже в интронах, возможно, что гипермутационный механизм не действует предпочтительно на эти участки. Поэтому высокая вариабельность последовательностей CDR может быть следствием отбора клеток, экспрессирующих мутантные CDR. Такой отбор может возникать либо из-за того, что изменения каркаса приводят к изменению общей укладки белка, либо в результате того, что мутации CDR могут повышать сродство к антигену и вследствие этого вести к усилению клональной экспансии.