Главная
|
Современная иммунохимияКлассические методы иммунохимического анализа, описанные ещё в конце XIX веке в работах таких выдающихся учёных как Эрлих, Борде, Ландштейнера основаны на образовании антителами в присутствии антигена преципитата (осадка), однако для визуальной регистрации процесса преципитации необходимы высокие концентрации компонентов и длительное время проведения реакции. Результаты такого анализа не всегда можно однозначно интерпретировать и, кроме того, в большинстве случаев они носят качественный или полуколичественный характер. Кроме того, для многих одновалентных антигенов (гаптенов), например гормонов, лекарственных соединений, эти методы непригодны. Индикация образовавшегося комплекса антиген - антитело в растворе может быть осуществлена, если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Весьма удобными для этой цели оказались изотопные, ферментные, флуоресцентные, парамагнитные метки, использование которых дало возможность увеличить чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз, а время анализа уменьшить до нескольких часов. Новые иммунохимические методы, основанные на применении меченых реагентов, нашли широкое распространение для количественного определения биологически активных соединений самой разнообразной структуры - от низкомолекулярных гормонов до высокомолекулярных вирусов и целых клеток. Наибольшее развитие среди них получил радиоиммунологический анализ (РИА), предложенный в конце 50-х годов. Благодаря возможности определять метку, которой являлся изотоп 125I , в очень малых концентрациях, удалось достигнуть высокой чувствительности анализа (на уровне пкг/мл). Разработка РИА явилась поворотным моментом в развитии иммунохимических методов анализа, положившим начало целой серии методов с использованием различных меченых соединений. За разработку метода его авторы Р. Йалоу и С. Берсон (Yalow and Berson) в 1977 г. были удостоены Нобелевской премии. Существуют разные варианты радиоиммуноанализа. Так, например, Майлес и Халес (Miles and Hales) в 1968 году использовали йодированные антитела в комбинации с антигеном на твёрдой фазе. В1978 году Лангон (Langone) предложил метить йодом белок А, который способен специфично связываться с Fc фрагментами антител. Таким образом, меченый белок А можно использовать как универсальный реагент. В 1979 Вейлером и Зенком(Weiler and Zenk) был предложен авторадиографический РИА, в котором они использовали мультиканальные плашки. Кроме того, в 1981 Аксельсон с коллегами(Axelson) разработали липосомный иммуноанализ, где антиген включался в меченые йодом липидные визикулы, которые затем могли быть осаждены антителами. Наряду с несомненными достоинствами РИА имеет и определённые недостатки, к
которым можно отнести следующие: В середине 60-х годов для идентификации и локализации антигенов в
гистохимических препаратах и выявления полос преципитации в иммунодиффузионных и
иммуноэлектрофоретических методах в качестве высокочувствительной метки было
предложено использовать молекулы ферментов. Являясь по своей природе мощными химическими
катализаторами, ферменты способны эффективно осуществлять наработку легко детектируемого продукта, что
делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях (до
10-12 М и ниже). На протяжении последних двух десятилетий иммуноферментные
методы анализа интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом
плане и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное
направление, имеющее важное прикладное значение. Использование твердых носителей
для сорбционной или ковалентной иммобилизации антител с последующим
специфическим связыванием анализируемого соединения на иммуносорбенте и
выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченных ферментами
компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного)
иммуноферментного анализа. Впервые такой анализ провели в 1971 году Энгвал и
Перлман (Е. Engvall и P. Perlmann) для IgG фракции, Ван Веемен и Шурс (К Van
Weemen и A. Schuurs) для эстрогенов (1971). В 1972 г. Рубенштейн с сотр. (К. Е. Rubenstein et al., 1972) разработали новый подход, заключающийся, в проведении всего анализа без использования твердой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА и был основан на учете различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунохимическом комплексе. В дальнейшем термин «гомогенный иммуноанализ» стал применим к любой системе иммуноанализа, в которой специфическая реакция взаимодействия антигена с антителом и определение глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе. Отсутствие стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения привело к сокращению времени проведения анализа до нескольких минут. Это исключительно важное обстоятельство позволило разработать диагностические иммуноферментные тест-системы экспресс определения биологически активных соединений, нашедшие широкое применение в химической токсикологии, фармакологии, эндокринологии. Внедрение гомогенного мультиканального варианта ИФА, получившего название EMIT-анализа (Энгвал, 1980), в область клинической биохимии содействовало созданию высокочувствительных методов количественного определения гормонов, наркотических и лекарственных веществ в биологических жидкостях, что дало возможность изучить их фармакокинетику и метаболизм в организме. Большим преимуществом метода EMIT-анализа является возможность использования малых объемов анализируемого образца (5-50 мкл) и отсутствие стадии его предварительной обработки. Развитие гомогенного ИФА начиналось с разработки методов определения низкомолекулярных соединений, затем появились новые модификации, позволяющие определять и высокомолекулярные антигены - альбумин, иммуноглобулины и т. д. Ещё один вариант иммуноанализа – флуоресцентный иммуноанализ (ФИА) c
использование флуоресцентных меток. Впервые такой анализ провели Смит и Хеммина
(Smith, 1981 and Hemmina, 1984). Потенциальная чувствительность флуорсцентных
методов очень высока, но на практике она лимитируется сигналом фона, который
может возникать из-за присутствия в растворе других флуорофоров. Существует
огромное количество разновидностей ФИА – как гомогенных, так и гетерогенных. Широкие возможности в ИФА открывает использование моноклональных антител,
специфичных строго к определенному антигенному участку анализируемого соединения
(1976 г. Kohler and Milstein, Нобелевская премия за получение моноклональных
антител in vitro). Надо также отметить работы Лайнуса Полинга
(1-я пол. XX в., США), которому удалось получить искусственные антитела. Кроме
того, он сформулировал постулат о комплементарности трёхмерной структуры
антигена и антитела (1942). Метод иммуноанализа находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа. Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров. Все возрастающее влияние на ИА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИА. |
|