| |
Главная
|
Маркирование с помощью 125[I]Будут описаны методы химического маркированиябычьий сывороточный альбуминпри помощи хлорамина Т и электрохимический способ маркирования ферритина. Используют изотоп 125[I] в виде изотонического раствора йодида натрия, не содержащего носителя и восстанавливающих примесей. Маркирование с помощью хлорамина Т Хлорамин Т представляет собой натриевую соль N-монохлор-паратолуолсульфонамида. В водных растворах от него отцепляется хлорноватистая кислота. Для маркирования белков необходима слегка щелочная среда (рН около 7,5), в таких условиях включение йода протекает количественно. Состав реакционной смеси: 10 мг БСА, 0,5 мл 0,5 М КН2Р04, 2,5 мл 0,5 М Na2HP04, 0,5 мл 0,0005 М KI, 40 МБк Na 125[I] (5 ГБк/мл), 0,8 мл хлорамина Т (1 мг/мл). Смесь медленно перемешивают в колбе Эрленмейера в течение 30 мин. Процесс останавливают добавлением 0,1 мл 0,2% раствора Na2S20s. Степень йодирования зависит от концентрации хлорамина Т, от продолжительности инкубации и от специфической активности метки (см. раздел "Антитела", "Клетки иммунной системы"). Электрохимическое йодирование Белок взаимодействует со свободным радиоактивным йодом, выделяющимся в ходе анодного окисления йодидов (необходимый потенциал равен примерно 388 мВ). Схема прибора представлена на рисунке. Электрическая схема аппарата для электрохимического маркирования белка
Р — платиновый тигель; М — платиновый катод; R —
сопротивление; К — компенсатор; Н — каломелевый электрод; В качестве анода используют платиновый тигель, в котором находится вещество, подлежащее маркированию. Перед использованием тигель тщательно прокаливают во избежание поляризационных эффектов. Катод сделан в виде платинового цилиндра. Он покрыт слоем коллодия или диализной мембраной. В качестве электролита используют 0,1 М NaCl. Нужное напряжение устанавливается при помощи потенциометра. Фактический потенциал определяют при помощи каломельного электрода компенсационным методом при сравнении с нормальным элементом. Перемешивание компонентов смеси осуществляют магнитной мешалкой. В случае работы с термолабильными веществами применяют охлаждение. В состав смеси входят 5 мг ферритина лошади, 1,5 мл 0,1 М NaCl, 0,1 мл 0,0005 М KI, 40 МБк Na I25[I] (4 ГБк/мл). Степень йодирования зависит от продолжительности электролиза и силы тока, помимо прочих вышеперечисленных условий. При анодном напряжении 700 мВ сила тока в начале процесса составляет около 100 мкА, спустя приблизительно 100 мин она снижается на 10 мкВ в зависимости от эффективной поверхности электрода. Увеличение анодного напряжения и продолжительности йодирования приводит к накоплению продуктов окисления. Выделение меченых белков из реакционной смеси Отделение меченых белков от несвязавшейся с белками радиоактивной метки, электролита и промежуточных продуктов проводят на сефадексе G-25. Реакционную смесь, содержащую радиоактивный йод, наносят на колонку размером 25x240 мм н элюируют 0,005 М трис-НСl-буфером с рН 8. Радиоактивность измеряют при помощи проточной кюветы на жидкостном сцинтилляторе, концентрацию белка — при помощи проточной кюветы (Увикорд) на волне 280 нм. Качество разделения определяют методом бумажной хроматографии (см. ниже). При гель-фильтрации меченый белок практически полностью отделяется от непрореагировавшего йода. Анализ препарата Меченые [125I] препараты оцениваются по специфической радиоактивности и по степени йодирования. Кроме того, проводят проверку электрофоретических и иммунологических свойств. Определение эффективности маркирования. Эффективность маркирования, т. е. долю связавшейся с белками метки, определяют с помощью осаждения белков ТХУ или методом восходящей бумажной хроматографии. Осаждение ТХУ. Из пробы, содержащей радиоактивный йод, отбирают аликвоту, смешивают ее с 1% БСА. После осаждения 10% ТХУ осадок собирают на мембранные фильтры (Хемапол, ЧССР, диаметр пор 0,45 мкм), фильтры промывают и измеряют радиоактивность осадка сцинтилляционным счетчиком. Хроматография на бумаге. Небольшое количество материала наносят на бумажную полоску 40x250 мм (FN14, Erzge-birge, ГДР) и проводят хроматографию в 70% водном растворе метанола. Распределение радиоактивной метки на хроматограмме определяют при помощи сцинтилляционного счетчика. Эффективность маркированиябычьий сывороточный альбумин химическим способом составляет 60—80%, электрохимическим — 30—50%. Оба метода дают несколько отличающиеся результаты, обусловленные различием в количестве метки, переходящей в ТХУ-растворимый материал с увеличением концентрации восстановителей. В среднем получаются белки со специфической радиоактивностью 0,7—2,2 МБк/мг белка. Определение степени йодирования. Степень иодирования, выраженную числом грамм-атомов йода, присоединенных к 1 молю белка, рассчитывают после определения концентрации белка в пробе по методу Лоури, а радиоактивности пробы — с помощью сцинтиляционного счетчика. Степень йодирования (СИ) определяют по формуле:
где А — радиоактивность белка (мин-1), А1-радиоактивпость
пробы (мин-1), Количество метки, попавшей в ТХУ-растворимую фракцию реакционной смеси, не учитывается. В случаебычьий сывороточный альбуминстепень йодирования близка к 1, в случае ферритина она значительно ниже. Электрофоретические свойства. Одной из характеристик меченого белка являются его электрофоретические свойства. Для сравнения используют немеченый белок. Оценку результатов проводят путем окрашивания амидо черным и радиоавтографии. Для макрорадиоавтографии применяют пленку ORWO-film AF4, которую разрезают на кусочки соответствующей величины и накладывают на пластины с агаром. Мягкое γ-излучение 125[I] особенно удобно для получения радиоавтографических изображений. Через 3—5 дней экспозиции пленку обрабатывают рентгеновским проявителем А 30 или МН-28. После проявления пленки проводят окрашивание пластины с гелем амидо черным для выявления полос белка. Сопоставляя окрашенные полосы белка в геле (йодированный и нативный белки) с полосами почернения на радиоавтограмме, можно сделать заключение о качестве меченого белка. Если белок частично денатурирован, часть метки остается у стартового желобка. Оценку фореграммы можно проводить непрерывным фото- и радиометрическим измерением пластинок и пленок. На рисунке ниже представлена фореграмма частично денатурированного БСА, окрашенная амидо черным. Электрофорез в геле бычьего сывороточного альбумина, меченного 125[I]
Продолжительность фореза 21/2 ч в EL-KF66; вероналовый буфер с рН 8,6; окрашивание амидо черным Иммунологические свойства. Изучение иммунологических свойств меченого белка в сравнении с исходными проводят при помощи иммуноэлектрофореза. В вырезанные лунки вносят меченые и, соответственно, немеченые белки. После электрофоретического разделения в боковые желобки вносят антисыворотку и оставляют пластины до завершения диффузии. Пластины высушивают, фиксируют и окрашивают амидо черным. Окрашенную пластину можно использовать для радиоавтографии. По положению дуг преципитации, образованию шлейфов и затемнений в месте нанесения белков судят о возможной денатурации меченых белков. На рисунке ниже представлена иммунофореграмма интактного ферритина, меченного 125[I]. Иммуноэлектрофорез интактного ферритина
Продолжительность фореза 31/2 ч; вероналовый буфер с рН 8,6; продолжительность диффузии 24 ч; окрашивание амидо черным Стабильность препаратов. Длительное хранение меченых белков приводит к потере ими йода. Дейодирование происходит как вследствие радиоактивного распада метки, так и вследствие взаимодействия с продуктами радиолиза воды. Кроме того, возможно ферментативное разрушение меченых компонентов. При хранении меченогобычьий сывороточный альбуминпри 4°С в течение 30 дней наблюдается незначительное увеличение радиоактивности, не связанной с белком. Если хранение происходит при 37 °С, то уже через 8 дней не связанная с белками радиоактивность возрастает до 15% от общей радиоактивности. Меченый 125[I] овальбумин дейодируется быстрее, чем БСА; ферритин подвергается дейодированию сравнительно медленнее. Потеря белками йода представляет собой процесс, на который оказывают воздействие различные физико-химические факторы, в том числе свет. В ходе хроматографии на бумаге часто наблюдается спонтанное дейодирование, зависящее от величины рН и от изменений концентрации реагентов. Этот эффект может быть уменьшен добавлением белка-носителя. Оценка метода Йодирование может изменять молекулярные и иммунобиологические свойства белков. Изменения связаны с заменой атомов водорода на сравнительно более крупные атомы йода, в некоторых случаях они обусловлены воздействием окислительных агентов. Как было отмечено выше, маркирование белков хлораминовым методом приводит к образованию частично денатурированных продуктов. При изменении условий может быть получен интактный в электрофоретической отношении БСА. Электрохимическое йодирование представляет собой более щадящий способ маркирования, однако оно используется сравнительно редко ввиду сложности аппаратуры. К числу его преимуществ относится хорошая воспроизводимость степени йодирования. Эффективность йодирования электрохимическим методом невысока. Варианты Известно большое количество окислителей, пригодных для процесса йодирования. Далее будут перечислены важнейшие из них, описаны наиболее часто используемые модификации в той мере, в какой они отклоняются от оригинальных методик. Модифицированный хлораминовый метод. Известен альтернативный метод йодирования без прямого использования хлорамина Т. При помощи хлорамина Т йодируют гидроксисукцинимидный эфир 3,4-гидроксифенилпропионовой кислоты. Продукт реакции экстрагируют бензолом и высушивают. Белок модифицируется в результате переноса ацильной группы на е-аминогруппы лизина или на N-концевые остатки белка. Преимущество данного метода состоит в том, что белок не вступает в непосредственный контакт с окислителями и восстановителями, йодирование становится возможным даже в отсутствие тирозиновых остатков у белка и, таким образом, не происходит изменения антигенных детерминант белка. Йодирование монохлоридом йода.
Это старейший метод маркирования, который применялся в период, когда не было препаратов с высокой специфической радиоактивностью. Степень йодирования зависит в основном от количества ICl. Метод отличается хорошей воспроизводимостью. Наряду с лактопероксидазой хлористый йод представляется средством выбора при маркировании белков, к тому же он является очень мягким окислителем, не изменяющим иммунологическую активность меченых белков. Метод основан на изотопном обмене. В условиях окислительного варианта монохлор-йодидного метода радиоактивный йодид непосредственно превращается в радиоактивный монохлорид йода, который затем взаимодействует с белком. Этот вариант позволяет получать наиболее высокую специфическую активность. Помимо альбумина и инсулина, этим методом можно также маркировать антитела. Ферментативное йодирование. Принцип ферментативного йодирования известен давно. Он позволяет получать препараты с высокой специфической активностью. Физико-химические и иммунологические свойства белка остаются при этом неизмененными. Основные сложности связаны с выбором фермента, так как можно использовать далеко не всякую пероксидазу. Для радиойодирования наиболее подходящим ферментом является лактопероксидаза. Чаще всего для работы используют коммерческие препараты пероксидаз, в том числе пероксидазу хрена. Ниже приводятся условия, в которых йодирование полипептидов проводится с применением лактопероксидазы. Состав смеси: в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,5 растворяют 50 МБк Na 125[I], 5 мкг полипептида или белка, 4 мкг лактопероксидазы и 1 мкл 0,88 М перекиси водорода; общий объем смеси составляет 50 мкл. После тщательного перемешивания при комнатной температуре процесс через 1—2 с останавливают добавлением 500 мкл фосфатного буфера. Не связавшуюся с белками радиоактивность удаляют гель-фильтрацией через колонку с сефадексом G-50, уравновешенную натрий-барбиталовым буфером. Для стабилизации меченого белка к каждому мл раствора добавляют 0,5 мл 1% раствора БСА. Перекись водорода можно вносить непосредственно или получать ее путем реакции глюкозы с глюкозооксидазой. Вышеописанным методом были получены меченые препараты пролактина, фрагментов антител и компонента комплемента Clq. Другие окислители. Описан метод получения меченых нуклеиновых кислот. Йодирование происходит в ацетатном буфере с рН 5 при температуре 60°С. В качестве окислителя используют ТlСl3. Метка включается в состав ДНК в виде 5-йодцитозина. Оценка метода Йодирование белка представляет собой простой, легко осуществимый процесс. Для этой цели можно использовать самые разнообразные окислители. Например, Clq, несмотря на его лабильность, можно метить и при помощи лактопероксидазы, при помощи и хлорамина Т. Получаемый меченый препарат комплемента позволяет во много раз повысить чувствительность определения иммунных комплексов. Маркирование белков зависит от очень большого числа параметров (рН, ионная сила, температура, концентрация реагентов и их химическая природа и т. д.), поэтому у каждого экспериментатора остаются большие возможности для поиска оптимальных вариантов маркирования соответствующих веществ. |
![Электрофорез в геле бычьего сывороточного альбумина, меченного 125 [I]](1/img/145.JPG)
