Главная

Цитотоксические лимфоциты после аллогенной иммунизации

Иммунизация.

Используют самок мышей инбредных линий А (Н-2а) и СВА (Н-2К) в возрасте 8—12 нед. А-мыши получают по 2х107 клеток селезенки СВА внутрибрюшинно. Контрольным животным вводят равное количество сингенных спленоцитов. Для построения графика изменений числа цитотоксических клеток животных забивают группами по 4 особи через каждые 2 дня в течение 26 дней.

Клетки лимфатических узлов как эффекторные клетки. Обработку лимфатических узлов (ингвинальные, мезентериальные, аксиллярные и цервикальные) проводят при 5°С, их очищают от жировой и соединительной ткани и помещают в среду I, измельчают в гомогенизаторе Поттера и переносят в центрифужные пробирки, профильтровав через найлоновую сетку. Суспензию центрифугируют в течение 6 мин при 100 g, осадок дважды отмывают средой I в тех же условиях. После 90-минутной инкубации в чашке Петри (удаление адгезирующих клеток) подсчитывают число клеток при помощи трипанового синего и доводят концентрацию суспензии до 30х106 клеток/мл.

Фибробласты как клетки-мишени. В качестве клеток-мишеней используют культуру фибробластов, выделенных из новорожденных мышей СВА (или эмбрионов). Обработку материала ведут при 37°С. У 4 животных отрезают головы, конечности и удаляют внутренности. Тела разрезают на мелкие кусочки и отмывают изотоническим ФСБ до обесцвечивания промывных вод. Инкубируют 4 мин в растворе трипсина (2,5 г трипсина/л). Надосадочная фракция содержит обломки клеток и эритроциты. Трипсинизацию проводят в Эрленмейеровской колбе на магнитной мешалке при 37°С. Количество трипсина должно приблизительно в 20 раз превосходить количество ткани (по объему). .Процесс прерывают каждые 10—15 мин и надосадочную фракцию, содержащую клетки, фильтруют через найлоновый фильтр в центрифужные пробирки. Процесс повторяют 6—8 раз. Суспензию клеток центрифугируют 10 минут при 200 g и один раз отмывают культуральной средой I. Выход составляет 35х106 клеток.

Суспензию переносят в культуральные сосуды на 1000 мл (сосуды Ру), добавляют по 100 мл среды I и инкубируют при 37 °С. Через 24 ч меняют среду. Через 3—5 дней можно сделать первый пассаж клеток или собирать клетки для опыта. Для этого среду сливают и ополаскивают клеточный «газон» ФСБ, Затем наливают по 2 мл раствора трипсина и версена (ЭДТА) (Chelaplex III, Berlin-Chemi, ГДР). Через 4—6 мин при 37°С клеточный слой разрыхляется. Надосадочную фракцию отбрасывают, клетки смывают предварительно прогретой средой I в подсчитывают. К 20х106 клеткам добавляют 1,5 мБк 3[Н]-тимидина. Устанавливают концентрацию суспензии 2,5х105/мл и после интенсивного перемешивания разливают по 2 мл в культуральные пробирки 160х16 мм. Пробирки кладут под углом 20°. Через 3 дня образуется монослой клеток. Несвязавшуюся радиоактивность удаляют трехкратным отмыванием ФСБ, затем вносят в пробирки по 1,5 мл среды I.

Проба на высвобождение 3[Н]-тимидина.

В пробирки вносят по 1 мл аллогенных иммунных и сингенных обработанных лимфоцитов. Пробы ставятся в 3 параллелях. Инкубируют 20 часов при 37 °С в косом положении. Сливают надосадочную фракцию, трижды ополаскивают пробирки ФСБ и суспендируют клетки в протозоле (New Englang Nuclear, США). После переноса суспензии в стаканчики для сцинтилляции измеряют радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике (например, LKB, Вгошгпа, Швеция). Для полноты данных необходимо определить нулевой контроль (клетки-мишени в присутствии среды) и минимальную активность (прочно связанную с клетками-мишенями радиоактивность, не высвобождаемую под воздействием эффекторных клеток). Для этого культуру клеток-мишеней обрабатывают тритоном Х-100 (неионный детергент; Ferak, Западный Берлин) или подвергают многократному замораживанию и оттаиванию. После центрифугирования в течение 10 мин при 200g проводят процедуры, описанные выше. Внесение клеток в протозоль вызывает сильную хемилюминесценцию пробы, которая пропадает примерно через 30 ч. Хранение образцов на холоде этот промежуток времени уменьшает. Образцы могут обладать различной степенью гашения, т. е. по-разному снижать эффективность подсчета распадов. В таких случаях рекомендуется построить калибровочную кривую, параметры которой (коэффициенты Уравнения 3-й степени) вводят в измерительное устройство. Счетчик радиоактивности выдает данные, выраженные в числе распадов в минуту (Desintegration per minute, DPM). Цитотоксичность определяют по уравнению 7 (см. раздел  «Расчет»). Если проанализировать рост цитотоксичности (%) в зависимости от времени, прошедшего после аллогенной иммунизации, то первый положительный ответ регистрируется через 30 ч, максимум клеточного иммунного ответа наблюдается к 5—6 дню и достигает 44%, затем кривая затухания антигенной стимуляции снижается и после 26 дней сенсибилизация вообще не обнаруживается.

Оценка метода, модификации.

Маркировка фибробластов 51 [Сг] широко используется. Обработка образцов в связи с этим сильно упрощается. Изменения не представляются особенно трудоемкими. Маркировка часто оказывается неудачной в связи с потерей клетками способности прикрепляться к стеклу, они перестают расти или, соответственно, отделяться от стекла.

Попытки метить фибробласты в суспензии 51 [Сг] в течение короткого периода времени (4 ч) оказались неудовлетворительными. Здесь следует отметить, что препараты хрома от различных изготовителей различаются по содержанию в них неактивного хрома, которым и обусловлен вышеприведенный эффект. Во многих моделях фибробласты являются оптимальными клетками-мишенями. Для поддержания постоянного соотношения эффекторы: мишени (Э: Ж) клетки, закладываемые в одну пробу, можно облучить дозой 30 Гр перед экспериментом. Маркировка 3 [Н]-тимидином выживших клеток-мишеней после инкубации с эффекторными клетками может повысить точность данных о значении цитолитического потенциала, поскольку включение 3 [Н]-тимидина строго пропорционально количеству клеток-мишеней.