Главная

• Антитела
• Реакция антиген-антитело
• Клетки иммунной системы
• История иммунологии
• Иммунохимия
• Продукты на страже иммунитета
• Вакцины
• Общие и частные проблемы иммунологии
• Основы иммунологии

Мембранная иммунофлюоресценция. Методика

Материалы и оборудование

Для работы необходимы: визотраст 370 (Fahlberg List, Магдебург, ГДР) или готовые растворы для разделения, например: фиколл — гипак (Pharmacia, Швеция); ФСБ (1,15 г Na₂HP0₄, 0,2 г КН₂Р0₄, 0,2 г КС1, 8 г NaCl, Н₂0 до 1000 мл, рН 7,2—7,3). Для стабилизации ФСБ добавляют человеческий сывороточный альбумин (Юг/л). Надо также иметь набор антисывороток, или препаратов AT, АС кролика против IgM человека и ФИТЦ-гаммаглобулин козы с антикроличьей специфичностью («особо чистый», Институт иммунных препаратов, Берлин), нормальную кроличью сыворотку.

Оснащение для инкубации клеток: пробирки (8X80 мм), пастеровские пипетки, камеры и пипетки для подсчета клеток, СН₃СООН (30 г/л), качалка (Labortechnik, Ильменау), центрифуга с охлаждением (Т23 или К.23, Лейпциг).

Оснащение для фиксации: предметные и покровные стекла, парафин, вентилятор, глицерин.

Техническое оснащение для ИФ-микроскопии: микроскопы Laboval 2a.fl и Fluoval II (Carl Zeiss, Йена) для работы с ФИТЦ и ТРИТЦ-меткой.

Объективы: Achromat 40/0,95 160/0,17; Achromat HI 100/1,40 160/0,17 (масляная иммерсия). Для фазово-контрастной микроскопии в проходящем свете: фазово-контрастный конденсор Phv Apl, 0,9е; объективы: Achromat 40/0,65 160/0,17, Achromat HI 100/1,40 160/0,17 Phv.

Оснащение для микрофотографии обычно имеется в стандартном наборе. Для черно-белых съемок применяют рентгеновскую пленку RS2 и NP27; для цветных съемок - ORWOCHROM VI 120 или Кодак Ektachrome High Speed 27 DIN.

Разделение лимфоцитов

Обычно используют разделение по Бейюму. Если в распоряжении исследователя нет фиколл — гипака, то можно использовать раствор рентгеноконтрастных средств (например, визотраст 370) с плотностью 1,077 г/мл.

1. Гепаринизированную или дефибринированную венозную кровь разводят ФСБ.

2. В центрифужные пробирки наслаивают по 4 мл разведенной крови на 4 мл разделяющего раствора.

3. Центрифугируют 20 мин не более чем при 430g, собирают интерфазу, содержащую лимфоциты, при помощи пастеровской пипетки. (В случае недостаточного разделения центрифугируют еще 5 мин.)

4. Лимфоциты ресуспензируют в тройном количестве ФСБ, центрифугируют (5 мин при 250 g), трижды повторяют отмывку. Хотя после разделения остается небольшое количество эритроцитов в препарате, оно не мешает проведению МИФ. Избыточное загрязнение эритроцитами можно устранить гипотоническим током (осадок клеток суспензируют в 1 мл дистиллированной воды при 4°С, через 30 сек добавляют избыток ФСБ и центрифугируют, осадок ресуспензируют в ФСБ). Сепарированные клетки на 85—95% состоят из лимфоцитов.

Инкубация лимфоцитов

Прямой метод:

1) устанавливают концентрацию лимфоцитов в суспензии 2х10⁷ клеток в 1 мл. По 0,25 мл суспензии вносят в пробирки и центрифугируют (5 мин, не больше чем при 180 g);

2) осадок (5х10⁶ клеток) суспензируют в 0,05 мл ФИТЦ-aHTH-Ig-сыворотки в оптимальном разведении), инкубируют, постоянно перемешивая, 30 мин при комнатной температуре;

3) трижды отмывают ФСБ, исследуют осадок микроскопически.

Непрямой метод:

1) см. прямой метод, п. 1;

2) осадок (5х10⁶ клеток) суспензируют в 0,1 мл (оптимальное разведение) кроличьей антисыворотки к Ig человека, инкубируют 30 мин при постоянном помешивании при комнатной температуре;

3) трижды отмывают ФСБ, осадок клеток суспензируют в 0,05 мл антивидовых глобулинов меченных ФИТЦ (в данном случае антикроличьих AT), инкубируют при постоянном перемешивании в течение 30 мин при комнатной температуре;

4) трижды отмывают ФСБ, осадок клеток исследуют микроскопически.

Фиксация, оценка результатов

Рекомендуется осадок, состоящий из меченых жизнеспособных лимфоцитов, немедленно ресуспензировать в ФСБ и приступить к оценке результатов (нанести каплю препарата на предметное стекло, накрыть покровным стеклом и герметизировать парафином, в случае хранения препарата в течение 30 мин и более (при 4°С). При получении фиксированного препарата для длительного пользования 1 каплю суспензии клеток наносят на предметное стекло, высушивают 10 мин при комнатной температуре, затем в течение 20 мин в токе холодного воздуха от вентилятора, по возможности в темноте. Высушенный препарат фиксируют 95% этанолом, ополаскивают холодным ФСБ, снова высушивают в токе холодного воздуха и покрывают препарат 1 М забуференным глицерином. Еще одним вариантом фиксации может быть приготовление мазков. Осадок клеток, меченных флюорохромом, суспендируют в 10 мкл человеческий сывороточный альбумин (200 г/л), делают мазок, высушивают его на воздухе и покрывают глицерином. Такие препараты могут сохраняться в течение 1 недели. После темновой адаптации препараты сравнивают по флюоресцентному и фазово-контрастному изображению. Для оценки МИФ проверяют не менее 100 клеток (лучше 200—300). Для подсчета результатов рекомендуется использовать счетно-механические приспособления, особенно если необходимо учитывать различные варианты МИФ. Типичные картины МИФ представлены на рисунке ниже. В качестве положительных примеров можно рассматривать типы МИФ 1 и 2.

Типы (1—5) флюоресценции лимфоцитов человека

Тип 1. Мелкоточечная флюоресценция клеточной мембраны, часто бывает видна в виде-кольца флюоресценции в экваториальной зоне: 1а - полная нли частично прерванная кольцевая флюоресценция («rings»), 16 - более трех отдельных гранул расположено по кругу («spots»). Тип 2. Флюоресценция клеточной мембраны в виде шапочкн («caps»). Тип 3. Цнтоплазматнческая флюоресценция. Тип 4. Диффузная флюоресценция. Тип 5. Грубы отложения флюоресцирующих частнц на клеточной мембране.

На рисунке 1, а и б пункты флюоресценции расположены по сферической поверхности, они проецируются в виде кольца в экваториальной области. Для удобства оценки результатов желательно, чтобы клетки были расположены по возможности отдельно друг от друга, поскольку места контакта клеток отличаются особо сильной флюоресценцией, что создает трудности для определения флюоресценции «Сар»-типа. В мазках по сравнению с препаратами суспензий примерно вдвое большее число лимфоцитов обнаруживает флюоресценцию «Сар»-типа. Равномерная флюоресценция мембран с диффузной флюоресценцией клеток может свидетельствовать о начинающемся повреждении мембран или равномерном распределении цитоплазматических и мембранносвязанных Ig при повышенной проницаемости клеточной мембраны. Типы неспецифической МИФ представлены на рисунке (фото 3, 4 и 5). Тип 3, редко встречающийся и характеризующийся интенсивной цитоплазматической флюоресценцией, по всей видимости, обусловлен интенсивным биосинтезом Ig. Диффузная флюоресценция, охватывающая ядра и слабо выраженная в области мембран, характерна для сильно разрушенных клеток, сквозь поврежденные мембраны которых проходят меченые AT. В ходе исследований изоантигенов Н-2 на «убитых» клетках из асцитической жидкости мыши было показано, что диффузная иммунофлюо-ресценция обусловлена повышенной проницаемостью поврежденных мембран. Образование крупных флюоресцирующих частиц (например, флюоресцирующих обломков клеток) является неспецифическим феноменом, обусловленным недостаточной отмывкой препарата.